結核分枝桿菌全基因組測序

文庫制備方法、測序和生物信息學分析技術發展迅速，且成本逐漸減低，為二代測序應用于病原菌感染性疾病診斷和分子流行病學分析帶來了革命性的進展。

隨著測序技術的日益成熟和生物信息學的發展，全基因組測序和分析已被廣泛應用于結核分枝桿菌的分子檢測（早期輔助診斷）、抗結核藥物敏感性的預測（指導臨床用藥和制定科學的治療方案），以及對地區傳播模式的分子流行病學研究（有助于發現和控制疫情）中，為解決結核病的早期診斷和耐藥問題，以及有效控制疫情傳播提供了很大的幫助。

晶諾專業致力于結核病相關的基礎和應用研究。針對結核分枝桿菌的基因組特征，建立了針對性、標準化的基因組提取和質控評估平臺，已有幾萬株結核分枝桿菌基因組數據生物信息學分析經驗。

下面詳細介紹一下晶諾的結核測序、分析平臺：

一、質控評估平臺

為了從源頭上保證測序數據的準確性、可靠性，對樣品提取、DNA檢測、建庫、測序每一個生產步驟都嚴格把控，從源頭上確保了高質量數據的產出。

（1）DNA提取：

基因組提取我們采用改良版的CTAB法，由經驗豐富的專業人員處理，以保證DNA的高質量。

（2）建庫前質控：

濃度檢測：Qubit熒光光度計

完整性檢測：瓊脂糖凝膠電泳

根據濃度、體積、總量、電泳結果來綜合評判樣本質量。

（3）文庫及測序數據質控：
文庫構建完成后，先使用Qubit 2.0進行初步定量，稀釋文庫，隨后使用Agilent 2100對文庫的插入片段進行檢測，插入片段大小符合預期后，使用Q-PCR方法對文庫的有效濃度進行準確定量分析，多個環節并重以保證文庫質量。文庫檢測合格后，按照有效濃度及目標下機數據量的需求將不同文庫pooling至flowcell，cBOT成簇后使用illumina高通量測序平臺NovaSeq 6000進行測序，原始數據量產出1G以上，測序平均深度可達200X以上。

二、結核菌全基因組測序數據分析平臺

（1）耐藥分析

基因型預測是基于異煙肼（ahpC、inhA、fabG1和katG）、利福平（rpoB）、乙胺丁醇（embA、embB和embC）和吡嗪酰胺（pncA）等耐藥性相關基因內或上游的突變。根據已知的結核耐藥突變數據庫，預測結核分枝桿菌對常用抗結核藥物（異煙肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、鏈霉素、氟喹諾酮、氨基糖苷類、阿米卡星、卡那霉素、卷曲霉素、乙硫異煙胺、對氨基水楊酸、環絲氨酸、利奈唑胺、貝達喹啉、氯法齊明、迪拉馬尼）的敏感性，全基因組測序涵蓋的基因組位點數量幾乎不受限制，但可能無法檢測到具有復雜基礎基因相互作用的耐藥機制。

耐藥分析示例：

圖1

圖2

圖1給出了樣本菌株的譜系、敏感、耐多藥或廣泛耐藥，以及對應藥物耐藥的突變點信息，其中-為未發現已知對應的藥物耐藥基因型。圖2為耐藥基因的突變頻率，突變點在樣本中可能有些菌株突變、有些未突變。

注：lineage1為環印度洋分枝、lineage2為東亞分枝（北京系）、lineage3為中亞東非印度分枝、lineage4為歐美分枝、lineage5和lineage6為主要流行于西非的非洲分枝，M. africanum West Africa 1 和 M. africanum West Africa 2、Lineage7 埃塞俄比亞分枝。

（2）遺傳距離分析——近期傳播關系

傳統分子流行病學方法一般使用IS6110 RFLP、spoligotype、VNTR等基因分型方法鑒定結核病傳播鏈，但使用全基因組測序的方法相較于基因分型具有更多的優勢，如全基因組測序具有更高的分辨率，全基因組測序是基于基因組間的SNP差異數來確定兩兩菌株間是否具有近期傳播關系，而傳統基因分型只是基于部分基因進行區分，結果可能造成基因型相同的菌株存在不同的傳播源和傳播路徑。另一方面，傳統基因分型很難準確鑒別傳播發生的路徑、順序及是否存在多個傳播源，而通過全基因組數據分析可解決此類問題。

遺傳距離分析示例：

該圖為每兩個菌株間的SNP差異數矩陣，一般認為SNP<12個，兩菌株間具有近期傳播關系，可結合流行病學調查鑒定地區結核病的傳播鏈。

此項分析在流行病學調查研究中更具有明顯優勢，隨著高通量測序的普遍應用及成本優勢，有望取代傳統的基因分型方法，成為分子流行病學的金標準。

除了以上常規分析內容，晶諾新增個性化分析內容——構建系統發育樹，并將以上的數據內容進行匯總圖形化顯示，更清晰區分各菌株間關系、藥物的敏感性、譜系及耐藥分類。

系統進化樹示例：

圖中線長短用于表示兩個菌株間的遺傳距離，譜系、耐藥分類使用顏色進行了區分，藥物敏感性使用了空實圈進行標注，黑色圓圈表示耐受對應藥物，白色圓圈表示對應藥物敏感。

除此之外，也可定制其它高級分析內容，歡迎咨詢！

 

分枝桿菌基因組提取樣品制備方法

一．樣品培養

1.固體培養

吸取一定體積的菌液（根據菌體濃度調整吸取體積）至固體培養基劃線（單線法、四區法均可），錫箔紙包裹，37°C倒置培養，直至克隆直徑為0.5-1 cm大小。

2.液體培養

挑取單克隆或吸取一定體積的菌液（根據菌體濃度調整吸取體積）至液體培養基中，培養基體積不超過容器總體積的1/5或特殊容器規定的最大培養體積。37°C靜置培養，直至菌液濃度達到OD600=0.8-1。

 

二. 樣品滅活

1.菌落處理方法

挑取黃豆粒大小的菌落至TE溶液（25 mM Tris-HCl (pH 8.0)，10 mM EDTA）中，盡量避免挑取任何固體培養基（混有培養基會影響后續基因組提取效果），TE溶液體積需淹沒菌落。金屬浴80℃加熱30分鐘。滅活后的樣品立即取出并凍存于-80℃冰箱。寄送前請勿反復凍融。

2.菌液處理方法

吸取1mL濃度達到OD600=0.8-1新鮮菌液至螺紋管中，13000 rpm離心10分鐘。棄掉上清，加入500 μL的TE溶液（25 mM Tris-HCl (pH 8.0)，10 mM EDTA）。金屬浴80℃加熱30分鐘。滅活后的樣品立即取出并凍存于-80℃冰箱。寄送前請勿反復凍融。

菌株分類	序號	菌株名稱	滅活條件
細菌	1	沙門氏菌	80℃水浴15min
	2	志賀氏菌	70℃水浴15min
	3	單核細胞增生李斯特氏菌	80℃水浴15min
	4	副溶血性弧菌	60℃水浴30min
	5	結核分枝桿菌	80℃水浴30min
	6	唐菖蒲伯克霍爾德	80℃水浴30min
	7	肺炎鏈球菌	60℃水浴30min
	8	流感嗜血桿菌	60℃水浴30min
	9	霍亂弧菌	60℃水浴30min
	10	創傷弧菌	60℃水浴30min
	11	非結核分枝桿菌	80℃水浴30min
	12	大腸埃希氏菌	70℃水浴15min
	13	鮑曼不動桿菌	80℃水浴30min
	14	幽門螺桿菌	80℃水浴30min
	15	肺炎克雷伯菌	60℃水浴30min
	16	支原體	60℃水浴30min
	17	銅綠假單胞菌	60℃水浴60min
	18	沙門氏菌	80℃水浴15min
	19	金黃色葡萄球菌	80℃水浴30min
	20	化膿鏈球菌	60℃水浴30min
真菌	1	白假絲酵母菌(白色念珠菌)	60℃水浴60min
	2	馬爾尼菲籃狀菌	60℃水浴60min
	3	新生隱球菌	60℃水浴10min

以上均為最佳滅活條件，如溫度過高、時間過長，或沒有加TE buffer，則可能影響提取效果。

請勿將干菌體直接進行滅活，根據晶諾實驗室的操作標準流程，干滅的樣本會被認為仍然存在風險，如仍需繼續項目，我們將啟動生物安全實驗室流程并產生費用，請注意！

 

如需TE Buffer，我們有100 mL和500 mL規格的產品，請與我們聯系。

產品名稱：TE緩沖液

產品貨號：60340K

 

三．樣品運輸

樣品在運輸途中避免溫度的變化而出現DNA降解，推薦10-15kg干冰運輸。

【溫馨小提示】

*凍存盒可用皮筋或膠帶纏好，如盒內有空隙可用干凈的紙填充，避免運輸過程中樣本晃動使蓋子打開。

*如用自封袋，請保證袋子不易破損和袋口密封，避免樣本掉落。可再套一兩個袋子。

*請勿直接將樣本管置于干冰中。

 

測序樣本命名標準

1、樣本編號只能由阿拉伯數字、字母、- 組成。例如A001-1是可以識別的編號。

2、不要用數字0作為開頭。

3、樣本編號不能包含中文、空格、/\ . : * ? ” < > | ① ②……等特殊字符，如有，分析時我們會用拼音替換中文，數字替換特殊字符。

 

 

分享一些有關結核分枝桿菌全基因組測序分方面的綜述文章，希望能對結核基因組測序感興趣的您有所幫助。

 

文獻分享：

1、張潔,任怡宣,潘麗萍,張宗德.全基因組測序在結核分枝桿菌研究中的應用[J].中國防癆雜志，2020年7月第42卷第7期.

鏈接：http://www.zgflzz.cn/CN/10.3969/j.issn.1000-6621.2020.07.017

2、徐鵬,甘明宇,高謙.二代測序技術在結核分枝桿菌研究中的應用進展[J].微生物與感染，2015年2月25日，10（1）：54-60.

鏈接：http://jmi.fudan.edu.cn/CN/abstract/abstract491.shtml